收到細胞后，請按照以下方法進行操作。

1. 取出25cm2培養瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO2細胞培養箱中靜置6-8小時或者過夜，以穩定細胞狀態。

2. 待細胞達到80%匯合時準備進行傳代培養。

3. 細胞傳代

1) 吸出25cm2培養瓶中的培養基，用PBS清洗細胞一次；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養液終止消化；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當的比例進行接種傳代，然后補充新鮮的*培養基至5mL，放入37℃，5% CO2細胞培養箱中培養；

4) 待細胞*貼壁后，培養觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養基。

產品名稱

名稱    小鼠角膜上皮細胞

2.組織來源：眼角膜組織

3.產品規格：5×105cells/T25細胞培養瓶

4.細胞簡介：

小鼠角膜上皮細胞分離自眼角膜組織；角膜位于眼球前壁的一層透明膜，約占纖維膜的前1/6，從后面看角膜呈正圓形，從前面看為橫橢圓形。角膜厚度各部分不盡相同，中央部最薄。角膜有十分敏感的神經末梢，如有外物接觸角膜，眼瞼便會不由自主地合上以保護眼睛。為了保持透明，角膜并沒有血管，透過外界空氣、淚液及房水獲取養份及氧氣。角膜分為五層，由前向后依次為：上皮細胞層、前彈力層、基質層、后彈力層、內皮細胞層。其主要功能如下：①角膜是的無血管的組織，具有透明的特性和合成許多蛋白的功能，分三層細胞層，外層即是上皮細胞；②角膜上皮細胞能參與先天性免疫，能感應病原體存在并發出信號從而激活角膜防御系統；③角膜上皮細胞能高效表達醛脫氫酶。角膜上皮細胞的體外培養對研究角膜的生理學、病理學、免疫學以及分子生物學都是極為重要的手段，常用于研究細胞代謝產物、病毒感染、各種生長因子和藥物對細胞生長的影響。

5.方法簡介：

實驗室分離的小鼠角膜上皮細胞采用胰蛋白酶-膠原酶混合消化法結合差速貼壁法，并通過上皮細胞專用培養基培養篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

6.質量檢測：

實驗室分離的小鼠角膜上皮細胞經PCK免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

7.培養信息：

包被條件鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養基含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

產品貨號CM-M120

換液頻率每2-3天換液一次

生長特性貼壁

細胞形態上皮細胞樣

傳代特性可傳1-2代

消化液0.25%胰蛋白酶

培養條件氣相：空氣，95%；CO2，5%

產品特點:

1、 使用方便:不需昂貴設備。

2、 可以處理各種細菌菌體，包括新鮮菌液和冰凍菌體。

3、 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時。

4、 采用溫和的中性裂解組分，保持蛋白活性。

5、 含蛋白穩定劑，提取的蛋白穩定。

6、 紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。

7、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等。

8、 本試劑盒中不有EDTA，與金屬螯和層析等兼容。

細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養基的培養瓶中培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。

4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

一、凍存時的注意事項：

1. 在冷凍保存之前，應觀察細胞生長是否良好(log phase) 且存活率高，凍存的細胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測細胞是否保有其*性質，例如是否有雜細胞或者支原體等。

3. 使用的DMSO 應為試劑級等級，以5~10 ml 小體積分裝，4 度避光保存，勿作多次解凍。使用的甘油也應為試劑級等級，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。

4. 冷凍保存的細胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細胞: 1~3 x 10^6 cells/ml，細胞濃度不要太高，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后。

4-3.貼壁腫瘤細胞: 1 x 10^6，依細胞種類而異。腺癌類的細胞解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml。

4-4. 懸浮細胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細胞須至少5 x 10^6 cells/ml。

5. 冷凍保護劑濃度為5 %或10 ％ DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。