3磷酸甘油酸激酶(PGK)測(cè)試盒微量法

本公司所有產(chǎn)品僅供科學(xué)實(shí)驗(yàn)，不做其他科學(xué)實(shí)驗(yàn)外的使用！
商品屬性：

測(cè)定意義：

3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的關(guān)鍵酶，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物體內(nèi)，催化 1，3-二磷酸甘油酸轉(zhuǎn)變?yōu)?3-磷酸甘油酸，產(chǎn)生 1 分子 ATP，具有影響 DNA 復(fù)制和修補(bǔ)及刺激病毒 RNA合成等生物學(xué)功能，廣泛應(yīng)用于藥物靶標(biāo)設(shè)計(jì)。

 測(cè)定原理

3-磷酸甘油酸激酶催化 3-磷酸甘油酸和 ATP 產(chǎn)生 1,3-二磷酸甘油酸和 ADP，1,3-二磷酸甘油酸在 3-磷酸甘油醛脫氫酶和 NADH 作用下產(chǎn)生 3-磷酸甘油醛、NAD 和磷酸，340nm 處的吸光度變化反映了 3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。 

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、低溫離心機(jī)、研缽、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板。

試劑組成和配制

提取液：液體 100mL×2 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加 2mL 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1 支，-20℃避光保存。臨用前加 1mL 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：粉劑×1 支，-20℃避光保存。臨用前加 1 mL 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑五：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加 4 mL 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。 酶液提取

①總 PGK 酶提取：建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1mL 提取液，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時(shí)間 1min），然后 4℃，500g 離心 5min，取上清測(cè)定。

②胞漿和葉綠體 PGK 酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5～10 的比例（建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1mL 提取液），冰浴勻漿后于 4℃，500g 離心 5min，棄沉淀，取上清在 4℃，8000g 離心 10min，取上清用于測(cè)定胞漿 PGK 酶活性，取沉淀加 1mL

提取液，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時(shí)間 1min），然后 4℃，500g 離心 5min，取上清測(cè)定葉綠體中 PGK 酶活性。

建議測(cè)定總 PGK 酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的 PGK，則按照步驟②提取粗酶液。

測(cè)定步驟:

1.分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。 

2. 取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 100μL 試劑一，20μL 試劑二，10μL 試劑三，10μL 試劑四，40μL 試劑五，20μL 粗酶液，充分混勻，記錄 340nm 處 10s 的吸光值 A1 和 310s 的吸光值 A2，△A=A1-A2

計(jì)算公式

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PGK（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(V 樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PGK（nmol/min /g 鮮重）＝ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10

3 L / mol /cm；d：比

色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.02mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反

應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g

b. 用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PGK（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(V 樣×Cpr) ÷T=643.08×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PGK（nmol/min /g 鮮重）＝ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=643.08×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10

3 L / mol /cm；d：比

色皿光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.02mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反

應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g

生化試劑盒的使用注意事項(xiàng)：

選擇合適的試劑盒：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜋z測(cè)對(duì)象選擇合適的試劑盒，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。

嚴(yán)格遵循說明書：按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作，避免誤用或浪費(fèi)。

注意保存條件：按照試劑盒的保存條件進(jìn)行妥善保存，避免陽(yáng)光直射、高溫或潮濕等不利因素。

控制實(shí)驗(yàn)條件：在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，如溫度、時(shí)間、pH值等，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。

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